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碳水化合物的代谢试验

来源:好安居资讯网
  

  其原理为:由于细菌各自具有不同的酶系统,对糖的分解能力不同,有的能分解某些糖产生酸和气体,有的虽能分解糖产生酸,但不产生气体,有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。具体试验方法有:①糖类发酵试验是鉴定细菌最常用的生化反应,特别是对肠杆菌的鉴定尤为重要;②葡萄糖代谢类型鉴别试验;③七叶苷水解试验;④淀粉水解试验;⑤甲基红试验;⑥V-P试验;⑦β-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)。

  1.糖(醇、苷)类发酵试验

  (1)原理:由于各种细菌含有发酵不同糖(醇、苷)类的酶,故分解糖类的能力各不相同,有的能分解多种糖类,有的仅能分解l~2种糖类,还有的不能分解。细菌分解糖类后的终末产物亦不一致,有的产酸、产气,有的仅产酸,故可利用此特点以鉴别细菌。

  (2)培养基:在培养基中加入0.5%~1%的糖类(单糖、双糖或多糖)、醇类(甘露醇、肌醇等)、苷类(水杨苷等)。培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。

  (3)方法:将分离的纯种细菌,以无菌操作接种到糖(醇、苷)类发酵培养基中,置培养箱中培养数小时至两周后,观察结果。若用微量发酵管,或要求培养时间较长时,应保持湿度,以免培养基干燥。

  (4)结果:接种的细菌,若能分解培养基中的糖(醇、苷)类产酸时,培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡,固体培养基内有裂隙等现象。若不分解,培养基中除有细菌生长外,无任何其他变化。

  (5)应用:是鉴定细菌最主要和最基本的试验,特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。

  2.氧化-发酵试验(0/F试验)

  (1)原理:细菌在分解葡萄糖的过程中,必须有分子氧参加的,称为氧化型。氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中,可以进行无氧降解的,称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。

  (2)培养基HL:Hugh-Leifson培养基。

  (3)方法:将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基,其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡(或其他矿物油),高度不少于lcm.将培养基于35℃培养48h或更长。

  (4)结果:两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型;两支培养基均产酸为发酵型;若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。

  (5)应用:主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别,前者均为发酵型,而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。

  3.β-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)

  (1)原理:有的细菌可产生β-半乳糖苷酶,能分解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG),而生成黄色的邻-硝基酚,在很低浓度下也可检出。

  (2)试剂:0.75MONPG溶液:取80mg溶于l5ml蒸馏水中,在加入缓冲液(6.9gNaH2P04溶于45ml蒸馏水中,用30%NaOH调整pH为7.0,再加水至50m1)5ml,置4℃冰箱中保存。0NPG溶液为无色,如出现黄色,则不应再用。

  (3)方法:从克氏双糖铁培养基上取菌,于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液,加入一滴甲苯并充分振摇,使酶释放。将试管置37℃水浴5min,加入0.25mlONPG试剂,水浴20min~3h观察结果。

  (4)结果:菌悬液呈现黄色为阳性反应,一般在20~30min内显色。

  (5)应用:迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性,而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。

  4.七叶苷水解试验

  (1)原理:有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素,七叶素与培养基中枸橼酸铁的二价铁离于反应,生成黑色的化合物,使培养基呈黑色。

  (2)培养基:七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。

  (3)方法:将待检菌接种于七叶苷培养基中,培养后观察结果。

  (4)结果:培养基变为黑色为阳性,不变色者为阴性。

  (5)应用:主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别,前者阳性,后者阴性。也可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。

  5.甲基红试验

  (1)原理:某些细菌在糖代谢过程中,分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解,产生甲酸、乙酸、乳酸等,使培养基的pH降至4.5以下,当加入甲基红试剂则呈红色,为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少,或产生的酸进一步转化为其他物质(如醇、酮、醚、气体和水等),则培养基的酸度仍在pH6.2以上,故加入甲基红指示剂呈黄色,是为阴性。

  (2)培养基:葡萄糖蛋白胨水培养基。

  (3)方法:将待检菌接种于上述培养基中,培养2~4d,于培养基内加入甲基红试剂,立即观察结果。

  (4)结果:呈现红色为阳性;橘红色为弱阳性;黄色为阴性。

  (5)应用:主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌,前者为阳性,后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性,而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。

  6.V-P试验

  (1)原理:某些细菌在糖代谢过程中,分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在碱性环境中,被空气中的氧氧化为二乙酰,进而与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用,生成红色化合物,则为V-P试验阳性。若培养基中胍基含量较少,则可加入少量含胍基化合物,如肌酸或肌酐等。试验时加入a-萘酚可加速此反应。

  (2)培养基:葡萄糖蛋白胨水培养基。

  (3)方法:将待检菌接种于上述培养基中,于35℃培养48h后加入甲液(6%α-萘酚酒精溶液)和乙液(40%KOH溶液),振摇。

  (4)结果:在数分钟内出现红色为阳性;如无红色出现且于35℃4h后仍如故者即为阴性。

  (5)应用:本试验常与甲基红试验一起使用,因为前者阳性的细菌,后者通常为阴性。


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